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產(chǎn)品分類污染向來是在細胞培養(yǎng)中的大問題。預(yù)防或治理污染是細胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。我們在細胞培養(yǎng)時,在開始階段就要十分重視污染問題,否則會前功盡棄,這樣不僅浪費時間,也會浪費人力、物力。
(一) 有哪幾類污染?
在細胞培養(yǎng)過程中的污染不只是指微生物,而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質(zhì),包括生物和化學(xué)物質(zhì)。
1、細菌污染
細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染,即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素,也可能因為操作不慎而引起污染。見的有革蘭氏陽性菌,如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌,其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細胞受細菌污染后,會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁,pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變,胞內(nèi)顆粒增多、增粗,后變圓脫落死亡。
2、真菌污染
真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中見的一種,的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細胞受真菌污染后,可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點,有的散在生長,培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁;倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中,有的呈鏈狀排列。真菌污染后,細胞生長變慢,但后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。
3、支原體污染
支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的小微生物,小直徑0.2μm,一般過濾除菌無法去除它,光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn),能在偏堿條件下生存,對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。 培養(yǎng)細胞受支原體污染后,部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢,部分細胞變圓,從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化,或略有變化,若不及時處理,還會產(chǎn)生交叉污染。
4、非同種細胞污染
由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開,往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前,世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染,致使許多實驗宣告無效。 細胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生,大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。
(二)污染類型的區(qū)別
1、細菌、真菌污染的檢測
(1) 肉眼觀察 ---- 細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生,而且增生迅速,若有污染,在48小時內(nèi)可明顯觀察到,例如培養(yǎng)液變混濁,或略加振蕩有很多漂浮物漂起。
(2) 接種觀察 ---- 用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種,也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。
(3) 鏡下觀察 ---- 倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮,即為細菌污染。細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。
2、支原體污染的檢測
(1) 相差顯微鏡觀察 ---- 接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上,再蓋上蓋片觀察,支原體在鏡下呈暗色微小顆粒,多位于細胞與細胞之間,有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn)。注意與細胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。
(2) 熒光染色法觀察 ---- 熒光染料Hoechst33258,此染料能與DNA特異地結(jié)合,可使支原體內(nèi)的DNA著色,熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點,散在于細胞周圍或附于細胞表面。
(3) 電鏡檢測 ---- 條件許可,可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養(yǎng)48~72小時,細胞接近匯合前,用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。
(4) 培養(yǎng)檢測 ---- 細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基,培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀,然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中,再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng),37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋"菌落出現(xiàn)。
(三)病毒的檢測
(1) 應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動物病毒病
(2) 逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)RT_PCR檢測病毒
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